乳歯歯髄幹細胞由来エクソソーム（SHED-Exos）またはEVを、骨格筋オルガノイドに滴下・添加し、筋組織修復促進効果を形態学的および免疫染色学的に評価する。特に、マクロファージのM1/M2極性変化との関連性を含めて、修復促進のメカニズムを解析する。
実験系の概要
| 項目 |
内容 |
| 対象 |
マウス骨格筋幹細胞由来の筋オルガノイド（3D培養） |
| 介入 |
SHED-EVsまたはSHED-Exos 滴下処理（単回・反復） |
| 観察時間 |
0時間、24時間、72時間、7日、14日など（経時観察） |
| 観察法 |
光学顕微鏡（組織形態）、共焦点レーザー顕微鏡（免疫染色）、画像解析ソフトで定量評価 |
| 主な評価指標（例） |
筋構造再生、M1/M2マクロファージの割合、ミオファイバー形成、核数、再生マーカー発現量 |
実験群
| 群名 |
内容 |
| Control群 |
SHED-EVなし（PBSのみ） |
| EV群（Low） |
SHED-EV低濃度（例：10 µg/mL）滴下 |
| EV群（High） |
SHED-EV高濃度（例：50 µg/mL）滴下 |
| Exosome群（精製済） |
超遠心等で精製したExosomeのみ投与 |
評価指標と観察項目
1. 筋オルガノイドの形態的再生指標
- 筋線維構造：ミオファイバーの伸長・分岐パターン（光学・レーザー）
- 中心核の形成：再生指標（DAPI染色と形態観察）
- ミオシン重鎖（MHC）発現：筋細胞分化の指標（免疫染色）
2. マクロファージの極性変化（M1 vs M2）
- M1マーカー：iNOS、CD86（免疫染色／共焦点観察）
- M2マーカー：Arg1、CD206（同上）
- それぞれのマーカー陽性細胞の割合または強度を画像解析ソフトで定量化（ImageJなど）
3. 細胞増殖・アポトーシス指標
- Ki-67：増殖指標（免疫染色）
- Caspase-3またはTUNEL染色：アポトーシス指標
4. ECMリモデリング・再生関連因子
- TGF-β1、IL-10：免疫調節因子（抗炎症性）
- TNF-α、IL-6：炎症性因子（M1誘導マーカー）
- VEGF：血管新生マーカー（再生の補助評価）
実験手順（例）
- Day 0
- 骨格筋オルガノイド播種（MatriGelなど使用）
- オルガノイド成熟（48–72時間）
- Day 2
- 各群にSHED-EVを滴下投与（1回、または24h毎の反復）
- Day 3〜14
- 各観察時点（24h, 72h, 7d, 14d）でサンプル固定・免疫染色
- 観察・画像取得
- 光学顕微鏡で形態スクリーニング
- 共焦点レーザー顕微鏡でマーカー発現評価
- ImageJ等で細胞数・蛍光強度などを定量化
データ解析
- 正規性確認後、One-way ANOVA＋Tukey法による多重比較
- M1/M2比、MHC陽性面積、核数、Ki67陽性率などの定量データを統計比較
考察ポイント
- EV投与により筋オルガノイドでM2マクロファージが増加→抗炎症環境の形成？
- M2増加とともにミオファイバーの再形成や中心核増加が起こるか？
- 高濃度と低濃度の差があるか？ Exosome精製群と全EV群に違いはあるか？